Банк рефератов содержит более 364 тысяч рефератов, курсовых и дипломных работ, шпаргалок и докладов по различным дисциплинам: истории, психологии, экономике, менеджменту, философии, праву, экологии. А также изложения, сочинения по литературе, отчеты по практике, топики по английскому.
Полнотекстовый поиск
Всего работ:
364150
Теги названий
Разделы
Авиация и космонавтика (304)
Административное право (123)
Арбитражный процесс (23)
Архитектура (113)
Астрология (4)
Астрономия (4814)
Банковское дело (5227)
Безопасность жизнедеятельности (2616)
Биографии (3423)
Биология (4214)
Биология и химия (1518)
Биржевое дело (68)
Ботаника и сельское хоз-во (2836)
Бухгалтерский учет и аудит (8269)
Валютные отношения (50)
Ветеринария (50)
Военная кафедра (762)
ГДЗ (2)
География (5275)
Геодезия (30)
Геология (1222)
Геополитика (43)
Государство и право (20403)
Гражданское право и процесс (465)
Делопроизводство (19)
Деньги и кредит (108)
ЕГЭ (173)
Естествознание (96)
Журналистика (899)
ЗНО (54)
Зоология (34)
Издательское дело и полиграфия (476)
Инвестиции (106)
Иностранный язык (62792)
Информатика (3562)
Информатика, программирование (6444)
Исторические личности (2165)
История (21320)
История техники (766)
Кибернетика (64)
Коммуникации и связь (3145)
Компьютерные науки (60)
Косметология (17)
Краеведение и этнография (588)
Краткое содержание произведений (1000)
Криминалистика (106)
Криминология (48)
Криптология (3)
Кулинария (1167)
Культура и искусство (8485)
Культурология (537)
Литература : зарубежная (2044)
Литература и русский язык (11657)
Логика (532)
Логистика (21)
Маркетинг (7985)
Математика (3721)
Медицина, здоровье (10549)
Медицинские науки (88)
Международное публичное право (58)
Международное частное право (36)
Международные отношения (2257)
Менеджмент (12491)
Металлургия (91)
Москвоведение (797)
Музыка (1338)
Муниципальное право (24)
Налоги, налогообложение (214)
Наука и техника (1141)
Начертательная геометрия (3)
Оккультизм и уфология (8)
Остальные рефераты (21697)
Педагогика (7850)
Политология (3801)
Право (682)
Право, юриспруденция (2881)
Предпринимательство (475)
Прикладные науки (1)
Промышленность, производство (7100)
Психология (8694)
психология, педагогика (4121)
Радиоэлектроника (443)
Реклама (952)
Религия и мифология (2967)
Риторика (23)
Сексология (748)
Социология (4876)
Статистика (95)
Страхование (107)
Строительные науки (7)
Строительство (2004)
Схемотехника (15)
Таможенная система (663)
Теория государства и права (240)
Теория организации (39)
Теплотехника (25)
Технология (624)
Товароведение (16)
Транспорт (2652)
Трудовое право (136)
Туризм (90)
Уголовное право и процесс (406)
Управление (95)
Управленческие науки (24)
Физика (3463)
Физкультура и спорт (4482)
Философия (7216)
Финансовые науки (4592)
Финансы (5386)
Фотография (3)
Химия (2244)
Хозяйственное право (23)
Цифровые устройства (29)
Экологическое право (35)
Экология (4517)
Экономика (20645)
Экономико-математическое моделирование (666)
Экономическая география (119)
Экономическая теория (2573)
Этика (889)
Юриспруденция (288)
Языковедение (148)
Языкознание, филология (1140)

Учебное пособие: Прыжки по хромосоме

Название: Прыжки по хромосоме
Раздел: Рефераты по биологии
Тип: учебное пособие Добавлен 14:40:14 07 августа 2009 Похожие работы
Просмотров: 59 Комментариев: 2 Оценило: 0 человек Средний балл: 0 Оценка: неизвестно     Скачать

Прыжки по хромосоме


Введение

В последнее десятилетие мы стали свидетелями целой серии ошеломляющих успехов в области молекулярной биологии. Разработка надежных методов клонирования, секвенирования и анализа экспрессии эукариотических генов углубила наши представления о структуре и регуляции активности гена, сделала более понятными механизмы многих наследственных болезней человека. В это же время быстро развивались и достигли значительных успехов методы картирования человеческих генов.

До недавнего времени существовал некий «провал» в области размеров хромосомных сегментов от 100 до 5000 т. п.н.; для них не имелось адекватных методов исследования. Такое положение значительно усложняло интерпретацию данных по картированию, полученных методами генетики соматических клеток и с помощью генетического анализа. Сопряжение таких данных с информацией, полученной на молекулярном уровне, стали называть «обратной генетикой».

В последние годы было предложено несколько подходов, позволяющих вести исследования в этой новой области. В настоящей работе описан один из них – метод «прыжков по хромосоме». С его помощью удается клонировать последовательности ДНК, значительно удаленные на генетической карте от последовательностей, гомологичных используемому зонду. Излагаются методики создания библиотек «хромосомных прыжков» и клонов-связок. Обсуждены преимущества и недостатки описываемого метода.


1. Область применения метода

Рис. 2 дает представление о размерах хромосомных сегментов, в пределах которых «работают» различные современные методы генетических исследований. Ось ординат представляет собой логарифмическую шкалу физических расстояний, измеренных в парах нуклеотидов. На шкале приведены и значения генетических расстояний, измеряемые в сантиморганидах. 1 см приблизительно равна 108 п.н. Однако это соотношение нельзя считать универсальным, ибо зависимость между генетическим и физическим расстоянием на хромосоме имеет нелинейный характер, на нее могут оказывать влияние «горячие точки» рекомбинации. Наличие таких областей может привести к ситуации, когда сравнительно большому генетическому расстоянию соответствует небольшой отрезок на физической карте. В то же время в геноме существуют участки, рекомбинация в которых маловероятна, а это приводит к обратной ситуации. Как показано на рис. 2, классические методы молекулярной генетики хорошо работают на последовательностях длиной до 50 г.п.н., что соответствует максимальному размеру вставки в космидный вектор. Участки большей длины можно клонировать путем «прогулки по хромосоме», когда, используя уже клонированные последовательности, геномную библиотеку скринируют с целью получения перекрывающихся клонов. Таким способом удаётся анализировать последовательности длиной до нескольких сотен т. п.н. Однако, в некоторых случаях эта процедура может занять очень много времени. Так будет, если какие-то участки практически не перекрываются из-за наличия протяженной области повторяющихся последовательностей или последовательностей ДНК, которые не удается ввести в стандартные векторы. Если известно, что интересующий нас ген находится на расстояний нескольких сотен т. п.н. от используемого клона, то применение метода «прогулки по хромосоме» весьма проблематично.


На противоположном конце спектра работают методы генетики соматических клеток, гибридизация insitu, анализ генетического сцепления; их разрешающая способность ограничена 1000–5000 т. п.н. И наконец, середине шкалы соответствуют три метода, позволяющие использовать данные картирования для поиска специфических молекулярных нарушений. Это пульс-электрофорез, «прыжки по хромосоме» и клонирование в клетках дрожжей.

Важность этих подходов в том, что они дают ключ к пониманию молекулярных основ целого ряда генетических нарушений, для которых неизвестна функция кодирующих их генов. Известны наследственные болезни человека, связанные с аномалиями отдельных генов, такие, например, как муковисцидоз, болезнь Гентингтона, нейрофиброматоз. Наследование их происходит строго в соответствии с менделевскими правилами, они имеют четкие фенотипические характеристики, однако нормальные функции генов, кодирующих эти заболевания, не определены. Анализ сцепления с использованием полиморфных ДНК-маркеров позволил картировать соответствующие гены в специфических хромосомах человека, что в свою очередь, значительно увеличило возможности пренатальной и пресимптоматической диагностики. Чтобы до конца разобраться в природе этих заболеваний и предложить адекватные методы их лечения, необходим молекулярно-биологический метод, работающий в области больших молекулярных размеров. Именно таким методом и являются «прыжки по хромосоме».

2. Стандартные библиотеки «прыжков»

2.1 Типы «прыжков»

Следует разграничить понятия стандартных геномных библиотек для «прыжков по хромосоме» и специфических библиотек. В первом случае библиотеки создаются таким образом, что начинать движение вдоль хромосомы отмеренными прыжками можно в принципе с любой точки генома. Специфические библиотеки состоят из клонов, позволяющих осуществлять прыжки от одного редко встречающегося сайта рестрикции, например Notl, к последующему такому же сайту. Типы прыжков схематически изображены на рис. 3. Очевидно, что способы создания этих библиотек несколько различаются. С технической точки зрения труднее получать библиотеки первого типа, так как они должны содержать репрезентативную выборку последовательностей генома. Обычно для такой библиотеки требуется 3*108 клонов. Тогда можно быть твердо уверенным, что с ней можно работать, начиная от любой стартовой точки на хромосоме.

Для создания же полных специфических библиотек требуется всего лишь 10000-20000 клонов, так как количество независимых клонов эквивалентно числу рестрикционных фрагментов, полученных при использовании данного фермента рестрикции. Так, например, для рестриктазы Notl, которая отщепляет приблизительно по 1000 т. п.н. в геноме человека, таких фрагментов должно быть всего лишь около 3000. Поэтому библиотеку из 10000 клонов для прыжков по Notсайтам можно считать практически полной. Очевидным недостатком таких библиотек является то, что их нельзя использовать, когда стартовая точка прыжка не примыкает к редко встречающемуся сайту рестрикции. К сожалению, это довольно частое явление, препятствующее быстрому распространению данного метода. Если же все-таки удается идентифицировать клон, примыкающий к редко встречающемуся сайту рестрикции, использование специфических библиотек для «прыжков по хромосоме» может оказать неоценимую помощь.

Очень эффективным могло бы оказаться создание геномной библиотеки третьего типа, имеющей в своем составе клоны, соединяющие редко встречающиеся сайты рестрикции с прилегающими случайными последовательностями ДНК генома. Имея такую библиотеку, мы могли бы начинать движение по хромосоме с любой стартовой точки, а при встрече с редким сайтом рестрикции пускать в ход специфическую геномную библиотеку. К сожалению, пока эта задача не решена и подходы к ее решению здесь обсуждаться не будут.

2.2 Принцип создания стандартных библиотек

Основная стратегия метода «прыжков по хромосоме» состоит в получении кольцевых формул очень крупных фрагментов ДНК путем лигирования их при большом разбавлении. Образование колец позволяет физически сблизить участки ДНК, расположенные в геноме на значительном расстоянии друг от друга. Селективное клонирование таких соединенных фрагментов в стандартные векторы позволяет затем получить геномную библиотеку клонов – «прыжков». Эта стратегия применительно к стандартным библиотекам схематически изображена на рис. 4.

Прежде чем приступить к созданию библиотеки, следует ответить на несколько важных вопросов.

1. Какой размер прыжка желателен? Известно, что размер прыжка определяется размером частично гидролизованных молекул ДНК. Как будет показано ниже, сложность построения библиотеки возрастает в степени 3/2 с увеличением размера прыжка.

2. Какой использовать фермент? В идеальном случае хотелось бы иметь совершенно случайный набор фрагментов ДНК.

3. Какой источник ДНК использовать? Для оптимальной реализации библиотеки при наличии самых разнообразных стартовых зондов было бы предпочтительнее использовать источник ДНК, представляющей весь геном организма, например периферические лимфоциты донорской крови в случае геномных библиотек человека. Если же предполагается исследование специфической хромосомы, лучше работать с гибридными соматическими клетками, содержащими именно эту хромосому на известном фоне хромосом других видов. Преимущество такой стратегии в том, что она позволяет сразу определить принципиальную ценность клона, полученного при помощи имеющейся библиотеки, путем простой проверки клонированного фрагмента на его принадлежность интересующей хромосоме.

2.3 Получение ДНК-фрагментов желаемого размера

ДНК, подвергаемая частичному гидролизу, должна быть достаточно высокомолекулярной. Методика приготовления образцов ДНК та же, что и для пульс-электрофореза,с той лишь разницей, что количество ДНК рассчитывается для препаративных целей.

1.Исходя из того, что одна клетка млекопитающего содержит 6,7пкг ДНК, необходимо вырастить их столько, чтобы получить достаточное количество ДНК. Обычно для создания библиотеки требуется 200мкг ДНК, что соответствует приблизительно 3х107 клеткам. ДНК должна быть очень высокого качества, поэтому очень важно растить клетки в оптимальных условиях. Можно приготовить клетки и из периферической крови центрифугированием в смеси Ficoll-Hypaque.

2. После сбора клеток аккуратно просчитайте их количество в гемоцитометре и суспендируйте в таком объеме фосфатно-солевого буфера, чтобы концентрация клеток составляла примерно 2хЮ7 /мл. Затем суспензию быстро смешайте с равным объемом расплавленной 2%-ной низкоплавкой агарозы в 125мМ ЭДТА при 40°С. Залейте в форму. Кроме стандартных ячеек форма должна иметь ячейки для блоков размером 2x8x135 мм, которые служат для получения ДНК в препаративных количествах. Полезно приготовить 10–20стандартных блоков с ДНК для тест-гидролизатов и два больших блока непосредственно для опытов.

3.Обработайте ДНК протеиназой К в присутствии больших количеств ЭДТА и N-лаурилсаркозина, как описано ранее.

4. Очищенную ДНК проверьте на нативность и на присутствие нуклеаз. Для этого инкубируйте половину содержимого блока при 37°С 3 ч с 10 мм MgCl2 и нанесите эту смесь, а также необработанную половину на OFAGE-гель или на гельдля электрофореза в инвертированном поле. Определите размер ДНК. Необработанная ДНК должна практически полностью остаться в лунке, а в обработанном магнием препарате не должно быть низкомолекулярных примесей. Только в этом случае можно использовать препараты для «прыжков по хромосоме». Если же в препаратах, обработанных магнием, налицо признаки деградации, значит они загрязнены нуклеазами и надо повторить обработку протеиназой К. Как правило, этого бывает достаточно, чтобы избавиться от загрязнений.

5. Из некоторых источников ДНК постоянно выделяется с небольшим количеством низкомолекулярных примесей размером 50–100 т. п.н., видимо из мертвых клеток. Наиболее характерно это для лимфобластов. Такие деградировавшие молекулы ДНК могут сильно искажать результаты «прыжков по хромосоме», поэтому необходимо удалить их из агарозных блоков перед обработкой рестриктазами. Для этого блоки помещают в лунки OFAGE-геля и проводят пульс-электрофорез в течение 2–3 ч с интервалами между импульсами 20 с. Молекулы ДНК размером менее 100 т. п.н. выходят из блоков в гель, а высокомолекулярная ДНК остается практически без изменения. Блоки затем можно изъять из геля, получив, таким образом, высококачественный материал для дальнейшего исследования.

6. Проведите контрольную рестрикцию половинок агарозных блоков различными концентрациями Mbol. Согласно данной методике, в каждой половине блока содержится примерно 3,3 мкг ДНК, следовательно, концентрация фермента составит от 0,01 ед./мкг до 0,045 ед./мкг. Остановите реакцию добавлением 10 мкл ЭДТА. Обработанные рестриктазой образцы поместите в гель и проведите пульс-электрофорез. Это поможет определить концентрацию фермента, оптимальную для получения фрагментов нужного размера. На рисунке наглядно продемонстрирована необходимость пре-электрофореза для удаления низкомолекулярных примесей ДНК перед обработкой рестриктазами.

7. При использовании больших агарозных блоков пропорционально увеличьте количество фермента, но так, чтобы концентрации фермента в ед./мкл и ДНК в мкг/мл остались прежними.

8.Обработанные рестриктазой препаративные блоки поместите в гель и, используя соответствующие маркеры, проведите пульс-электрофорез с интервалами между импульсами, позволяющими хорошо отделить фрагменты нужной величины.

Если используется OFAGE-гель, маркеры следует наносить в середине и по обоим краям геля. Мы обнаружили, что для получения прямых полос молекул ДНК желаемых размеров лучше использовать CHEF-гели и гель-электрофорез в инвертированном поле.

9.Важно, чтобы ДНК, которую предстоит клонировать, не подвергалась ультрафиолетовому облучению. Поэтому отрежьте края геля, содержащие маркеры, а также небольшое количество рестрицированной геномной ДНК, окрасьте ихбромидом этидия и визуализируйте в ультрафиолете. По полученным данным определите участок геля с интересующей вас ДНК.

10.Вырежьте нужный участок геля. На этой и последующих стадиях важно использовать безнуклеазные реактивы и инструменты. Выделять ДНК из геля для получения кольцевой молекулы можно двумя способами. Нам представлялось удобным делать это методом электроэлюции. Поместите кусочек геля с ДНК в диализный мешок, залейте четырьмя объемами электрофорезного буфера, а затем поместите мешок в камеру для горизонтального электрофореза. Элюируйте ДНК из геля в течение двух часов 0,5хТВЕ-буфером при постоянном напряжении 100 В.Чтобы убедиться, что вся ДНК элюирована, можно вскрыть диализный мешок, достать гель и окрасить бромидом этидия. После удаления геля снова запечатайте диализный мешок и отдиали-зуйте ДНК против 10мм Трис, рН 7,4, 1мм ЭДТА с несколькими сменами буфера, подготовив таким образом препарат для лигирования.

11.Препаративные гели для определения размеров ДНК можно готовить из легкоплавкой агарозы. И тогда выделять ДНК из них можно, вырезая нужные участки и расплавляя их при 65°С. После того как гель расплавится, ДНК доводят до нужной концентрации и проводят лигирование в присутствии агарозы, которая не ингибирует эту реакцию. В настоящее время нет оснований предпочитать один метод другому. Важно лишь избегать операций, которые могли бы нарушить целостность молекул ДНК после извлечения их из геля. Нельзя центрифугировать, встряхивать, пипетировать препараты. И желательно как можно скорее приступать к их лигированию.


2.4 Циклизация

Успех или неудача «прыжков по хромосоме» в решающей степени определяются возможностью лигировать большие сегменты ДНК с образованием кольцевых молекул. Анализ стратегии этого метода, схематически изображенной на рис. 4,показывает, что тандемное лигирование молекул ДНК дает сцепленные фрагменты, соединяющие в себе две случайные последовательности. Такое сцепление приводит к образованию аномальных клонов, которые провоцируют «прыжки по хромосоме» из данной стартовой точки на какую-то случайную последовательность генома. Свести к минимуму риск возникновения такого события можно, проводя лигирование при достаточно низких концентрациях ДНК так, чтобы на долю тандемных лигирований приходилось менее 5–10%.

Теория лигирования ДНК при низких концентрациях была разработана в 50-е годы Джекобсоном и Стокмайером. Для некоторых размеров последовательностей ДНК теоретические прогнозы подтвердились экспериментально. Очень полезно, например, следующее соотношение:

где j– концентрация молекул ДНК контурной длины / и сегментной длины b, при которой с равной вероятностью лигируются как разные молекулы, так и концы одной молекулы. Очевидно, что для эффективной циклизации лучше работать с концентрациями гораздо более низкими, чем /. Подставляя в уравнение известные параметры ДНК для водного раствора, его можно преобразовать следующим образом:


где т.п.н. – длина ДНК в тысячах пар нуклеотидов. При данной концентрации ДНК i– доля лигирований, приводящих к циклизации. Чтобы эта доля достигала 90%, работать следует с концентрацией ДНК, определяемой уравнением:

Обычно для получения 3х106 клонов в библиотеке, необходимо после расщепления циклизованных молекул ДНК иметь 0,5 мкг сцепленных фрагментов. Средний размер такого фрагмента 5 т. п.н., а это значит, что для осуществления прыжков в 100 т. п.н. необходимо иметь 10 мкг фракционированной по размеру ДНК; для прыжков в 200 т. п.н. – уже 20 мкг. На интенсивность лигирования влияют два фактора: 1) количество ДНК, необходимое для получения достаточного числа сцепленных фрагментов и создания геномной библиотеки. Это количество возрастает линейно с увеличением размера прыжка; 2) необходимость преимущественного получения циклизованных молекул. Интенсивность лигирования с циклизацией возрастает пропорционально квадратному корню длины молекул ДНК. Поэтому с увеличением размера прыжка объем лигазной смеси должен возрастать пропорционально 3/2 степени длины молекулы ДНК. В табл. 1 приведены стандартные параметры для создания геномной библиотеки, рассчитанной на прыжки в 100 т. п.н.

Очень важно маркировать в кольцевых молекулах места соединения фрагментов с тем, чтобы селективно клонировать их на последующих стадиях. В качестве селективного маркера мы использовали ген супрессорной тРНК – supF, хотя возможны и другие способы селекции. Супрессорный ген должен иметь концы, комплементарные Mfeol-концевым фрагментам геномной ДНК – Для этой цели было взято несколько supFс различающимися концевыми последовательностями, полученными при обработке рестриктазной Ват.

Ниже представлена методика реакции циклизации.

1. Используя приведенные выше уравнения, растворите ДНК и доведите раствор до нужной концентрации в 50 мМ Трис, рН 7,4, 1 мМЭДТА.

2. Добавьте 100 или 500-кратный молярный избыток ДНК BamHI-фрагмёнтов supF, предварительно проверенных на эффективность лигирования. Для этого проведите самолигирование и последующий анализ геля. По нашему мнению, наиболее удобно получать фрагменты генов supFэлектрофорезом с последующей электроэлюцией. Важно, чтобы фрагмент был максимально очищен от плазмиды, поскольку даже незначительные количества ее могут проявиться в окончательной библиотеке в виде клонов, гибридизующихся с зондом, несущим плазмиду. Оставьте смесь supFДНК с геномной ДНК на полчаса.

3. Доведите концентрацию магния до 10 мМ и оставьте смесь еще на 10 мин, чтобы установилось равновесие. Затем добавьте ДНК-лигазу бактериофага Т4 до конечной концентрации 1–2 ед./мкл. Лигируйте 12 ч при 14°С, затем добавьте вторую порцию лигазы и лигируйте еще 12 ч. Осадите циклизовавшуюся ДНК этанолом, добавив 20 мкг дрожжевой тРНК-носителя. Отцентрифугируйте осадок при 23000об/мин в роторе SW27. Ресуспендируйте осадок в 100мкл ТЕ и инактивируйте все нелигировавшиеся концы, либо обработав их щелочной фосфатазой, либо добавив фрагмент Клёнова ДНК-полимеразы I. Эта стадия очень важна, так как, если лигирование при низких концентрациях происходит не полностью, свободные фрагменты могут аномально лигироваться с вектором. Экстрагируйте ДНК фенолом, осадите и, растворив, снова обработайте EcoRl.

5.Для контроля очень полезно на каждой стадии отбирать небольшие аликвоты и подвергать их электрофорезу в 1,4%-ном агарозном геле с последующим переносом на нитроцеллюлозу или полиамид и блот-гибридизацией с supF-гтом. В случае успешной реакции циклического лигирования ДНК гена supFбудет давать полосы в виде лестницы, и небольшое ее количество должно оказаться в той зоне геля, которая соответствует высокомолекулярной ДНК. После обработки рестриктазой ЕсоЩ лесенка supF-гена должна остаться, а полосы из высокомолекулярной области должны расщепиться на множество фрагментов размером от 1 до 20 т. п.н.

6. ДНК, обработанную ЕсоШ, экстрагируйте фенолом и осадите этанолом.

2.5 Клонирование и скрининг

На этой стадии обработанные кольцевые молекулы геномной ДНК уже можно лигировать и производить селекцию сцепленных фрагментов. Для селекции геномные фрагменты встраивают в фаговый вектор, несущий амбермутации по крайней мере двух генов белковой оболочки, упаковывают фаговую ДНК invitro и инфицируют клетки бактерии-хозяина, лишенные функции supF. Формировать бляшки на таком газоне могут только те фаговые частицы, геномы которых содержат собственные supF-гены.

Теоретически подходит любой фаговый вектор, несущий амбер-мутации и клонирующий сайт. Желательно, конечно, чтобы этот вектор обеспечивал максимальную клонирующую емкость. Идеальной можно считать ситуацию, когда кольцевые геномные фрагменты расщеплялись бы лишь частично мелкощепящим ферментом, а затем лигировались в вектор большой емкости, чтобы не было дискриминации фрагментов, обусловленной расположением сайтов рестрикции. Однако обязательные потери, происходящие при частичном расщеплении, оказываются препятствием на пути создания полной библиотеки. Имеющиеся у нас в настоящее время стандартные геномные библиотеки для «прыжков по хромосоме» были получены в результате полного расщепления кольцевых геномных фрагментов рестриктазой EcoRl. Можно использовать и другие ферменты, для которых имеются амбермутантные фаговые клонирующие векторы.

2.6 Анализ клонов

После очистки бляшек можно приготовить минилизат ДНК из клонов, руководствуясь любой стандартной методикой. Использование на этой стадии в качестве газона LE392 позволяет получить несколько больший выход фаговой ДНК, чем при посеве на МС1061. Обработка рестриктазой ЈcoRI позволит определить размер инсерционного фрагмента. Если в данном клоне имеется более одного fcoRI-фрагмента, это значит, что при клонировании в один вектор были лигированы две вставки. В таком случае следует провести блот-гибридизацию данного клона с исходным зондом и с supF, чтобы определить, находятся ли эти вставки в одном EcoRI-фрагменте или в разных. В первом случае с клоном можно продолжать работать дальше традиционными методами; во втором случае он не представляет ценности для дальнейших исследований.

ZTcoRI-фрагмент полезно переклонировать в плазмиду, чтобы упростить работу по его изучению. Субклоны можно легко идентифицировать, благодаря наличию SHpF-маркера. Рестрицированный минилизат ДНК можно лигировать в pBR322, предварительно обработанную ЈcoRI и фосфатазой, и полученной рекомбинантной ДНК трансформировать штамм бактерии-хозяина, несущий какую-либо амбермутацию в lacZ, например CARD-15. Высев культуры на агар Мак-Конки с ампициллином позволяет практически сразу выявить интересующие колонии, так как они способны сбраживать лактозу и окрашены в пурпурный цвет в отличие от остальных, шмеющих розовую окраску.

Для того чтобы разделить стартовую и конечную точки прыжка, очень полезно использовать присутствие сайта в центре гена supF. Особенно эффективно это в том случае, когда имеющийся в pBR322 сайт Avalэлиминирован. Мы добивались этого, проводя последовательно обработку плазмиды рестриктазой Aval, достраивание фрагментом Клёнова и повторное лигирование. Отделить половины клонированного фрагмента можно, обрабатывая субклоны EcoRl, Avalи обеими рестриктазами одновременно. Лиасайты встречаются иногда в геномных последовательностях, что несколько затрудняет составление карты. Однако при помощи блот-гибридизации рестрицированных субклонов с исходным зондом, supFи геномной ДНК человека, позволяющей локализовать повторы, обычно легко удается построить рестрикционную карту и идентифицировать уникальные последовательности. А это, в свою очередь, позволяет определить, является ли данный прыжок эффективным. Результаты блот-гибридизации представляют особый интерес, так как с их помощью удается идентифицировать ближайшие к супрессорному гену фрагменты.

В случае же использования supFс дополнительными вставками редко встречающихся сайтов рестрикции разделение половинок фрагмента, составляющего прыжок, упрощается, и зонды можно получать непосредственно из минилизатафаговой ДНК. После того как установлено, что фрагмент – «прыжок» представлен в геноме единичной копией, надо провести его гибридизацию с блотом геномной ДНК из гибридных соматических клеток, чтобы убедиться, что прыжок осуществлен в пределах нужной хромосомы. Это очень важный момент, так как при создании геномной библиотеки всегда существует опасность нециклического лигирования.

Оценить/Добавить комментарий
Имя
Оценка
Комментарии:
Где скачать еще рефератов? Здесь: letsdoit777.blogspot.com
Евгений07:15:27 19 марта 2016
Кто еще хочет зарабатывать от 9000 рублей в день "Чистых Денег"? Узнайте как: business1777.blogspot.com ! Cпециально для студентов!
19:32:36 28 ноября 2015

Работы, похожие на Учебное пособие: Прыжки по хромосоме

Назад
Меню
Главная
Рефераты
Благодарности
Опрос
Станете ли вы заказывать работу за деньги, если не найдете ее в Интернете?

Да, в любом случае.
Да, но только в случае крайней необходимости.
Возможно, в зависимости от цены.
Нет, напишу его сам.
Нет, забью.



Результаты(150051)
Комментарии (1830)
Copyright © 2005-2016 BestReferat.ru bestreferat@mail.ru       реклама на сайте

Рейтинг@Mail.ru