Банк рефератов содержит более 364 тысяч рефератов, курсовых и дипломных работ, шпаргалок и докладов по различным дисциплинам: истории, психологии, экономике, менеджменту, философии, праву, экологии. А также изложения, сочинения по литературе, отчеты по практике, топики по английскому.
Полнотекстовый поиск
Всего работ:
364150
Теги названий
Разделы
Авиация и космонавтика (304)
Административное право (123)
Арбитражный процесс (23)
Архитектура (113)
Астрология (4)
Астрономия (4814)
Банковское дело (5227)
Безопасность жизнедеятельности (2616)
Биографии (3423)
Биология (4214)
Биология и химия (1518)
Биржевое дело (68)
Ботаника и сельское хоз-во (2836)
Бухгалтерский учет и аудит (8269)
Валютные отношения (50)
Ветеринария (50)
Военная кафедра (762)
ГДЗ (2)
География (5275)
Геодезия (30)
Геология (1222)
Геополитика (43)
Государство и право (20403)
Гражданское право и процесс (465)
Делопроизводство (19)
Деньги и кредит (108)
ЕГЭ (173)
Естествознание (96)
Журналистика (899)
ЗНО (54)
Зоология (34)
Издательское дело и полиграфия (476)
Инвестиции (106)
Иностранный язык (62792)
Информатика (3562)
Информатика, программирование (6444)
Исторические личности (2165)
История (21320)
История техники (766)
Кибернетика (64)
Коммуникации и связь (3145)
Компьютерные науки (60)
Косметология (17)
Краеведение и этнография (588)
Краткое содержание произведений (1000)
Криминалистика (106)
Криминология (48)
Криптология (3)
Кулинария (1167)
Культура и искусство (8485)
Культурология (537)
Литература : зарубежная (2044)
Литература и русский язык (11657)
Логика (532)
Логистика (21)
Маркетинг (7985)
Математика (3721)
Медицина, здоровье (10549)
Медицинские науки (88)
Международное публичное право (58)
Международное частное право (36)
Международные отношения (2257)
Менеджмент (12491)
Металлургия (91)
Москвоведение (797)
Музыка (1338)
Муниципальное право (24)
Налоги, налогообложение (214)
Наука и техника (1141)
Начертательная геометрия (3)
Оккультизм и уфология (8)
Остальные рефераты (21697)
Педагогика (7850)
Политология (3801)
Право (682)
Право, юриспруденция (2881)
Предпринимательство (475)
Прикладные науки (1)
Промышленность, производство (7100)
Психология (8694)
психология, педагогика (4121)
Радиоэлектроника (443)
Реклама (952)
Религия и мифология (2967)
Риторика (23)
Сексология (748)
Социология (4876)
Статистика (95)
Страхование (107)
Строительные науки (7)
Строительство (2004)
Схемотехника (15)
Таможенная система (663)
Теория государства и права (240)
Теория организации (39)
Теплотехника (25)
Технология (624)
Товароведение (16)
Транспорт (2652)
Трудовое право (136)
Туризм (90)
Уголовное право и процесс (406)
Управление (95)
Управленческие науки (24)
Физика (3463)
Физкультура и спорт (4482)
Философия (7216)
Финансовые науки (4592)
Финансы (5386)
Фотография (3)
Химия (2244)
Хозяйственное право (23)
Цифровые устройства (29)
Экологическое право (35)
Экология (4517)
Экономика (20645)
Экономико-математическое моделирование (666)
Экономическая география (119)
Экономическая теория (2573)
Этика (889)
Юриспруденция (288)
Языковедение (148)
Языкознание, филология (1140)

Реферат: Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе

Название: Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе
Раздел: Рефераты по медицине
Тип: реферат Добавлен 00:19:47 05 августа 2009 Похожие работы
Просмотров: 214 Комментариев: 3 Оценило: 1 человек Средний балл: 5 Оценка: неизвестно     Скачать

Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе


Введение

В последние годы в качестве альтернативы радионуклидам в иммуноанализе нашли широкое применение неизотопные метки, в том числе ферменты, хемилюминесцентные соединения, флуорофоры и коллоидные частицы. Применение неизотопных маркеров затрудняется необходимостью синтезировать, очищать и охарактеризовывать белковые конъюгаты в случае каждого определяемого вещества. Ранее система авидин – биотин нашла широкое применение при локализации, обнаружении и очистке белков. Оказалось, что эта система не менее полезна и в иммуноанализе.

В работе детально рассмотрены два подхода, с помощью которых авидин-биотиновая реакция может быть использована в двухцентровом иммуноанализе. В обоих подходах применяли препараты иммобилизованных и биотинилированных антител. Эти препараты отбирали по принципу распознавания различных эпитопов антигена. В первом подходе сначала иммобилизованные антитела вводили в реакцию с исследуемым образцом и биотинилированными антителами. Затем добавляли конъюгат авидина или стрептавидина с ферментом или с хемилюминесцентным маркером. Во втором подходе вместо белкового конъюгата добавляли свободный авидин или стрептавидин и затем добавляли биотинилированный фермент. В обоих случаях определение осуществляли спектрофотометрически или по интенсивности люминесценции после добавления соответствующих субстратов. В качестве биотинилированных ферментов-маркеров применяли пероксидазу хрена, АВ+ -зависимые ферменты, АТР-зависимые ферменты, пенициллиназу и щелочную фосфатазу. Рассмотрим некоторые результаты, полученные с помощью этих двух подходов.


Основные принципы

Уже давно известно, что для обеспечения сильного взаимодействия биотина с гликопротеином яичного белка авидином требуется только уреиднос кольцо витамина. Следовательно, карбоксильную группу остатка валериановой кислоты в биотине можно модифицировать и таким образом получать активные биотинилированные производные. В частности, биотин, связанный с макромолекулой, сохраняет способность связываться с активным центром авидина. Поскольку молекула авидина состоит из четырех идентичных субъединиц, то с ней могут быть одновременно связаны остатки биотина двух различных биотинилированных белков. Эти свойства авидии-биотинового комплекса широко используются для решения различных задач, в том числе 1) обнаружения, локализации и очистки белков, углеводов и нуклеиновых кислот; 2) разработки методов двухцентрового иммунометрического анализа; 3) картирования эпигонов в гибридомной технологии.

Практическое применение авидин-биотиновой системы ограничивается высокой основностью авидина и наличием в его молекуле углеводных остатков, что в свою очередь обусловливает высокий уровень неспецифического связывания. Более 20 лет назад в бактериях Streptomycesavidiniiбыл обнаружен другой биотинсвязывающий белок, названный стрептавидином. Подобно авидину яичного белка, стрептавидин также образует очень прочный и специфический нековалент-ный комплекс с биотином и состоит из четырех идентичных субъединиц. Каждая субъединица содержит один биотинсвязываюший центр. В отличие от авидина стрептавидин негликозилирован и имеет нейтральную ph. Авидин и стрептавидин сильно различаются по аминокислотному составу, хотя оба богаты остатками триптофана. Некоторые свойства этих белков приведены в табл. 1.


Таблица 1. Некоторые характеристики авидина и стрептавидина

Характеристики Авидин Стрептавиднн
tМолекулярная масса 67 000 60 000
Мол. масса субъединицы 15 600 14 600 .
Kd (авидин-биотиновый комплекс), М -10-15 -10-15
Еш (1 мг/мл) 1,54 3,4
Связывание биотина на субъединицу 1 1
Олигосахариды на субъединицу 1 0
Манноэа на субъединнцу 4-5 0
GlcNAc* ва субъединицу 3 0
Иэоэлектрическая точка, pi >10 <7
Остатки аминокислот на субъеднницу
Триптофавы 4 8
Тироэины 1 6
Лиэины 9 4
Аргинины 8 4
Аспарагин + аспарагиновая кислота 15 12
Глутамин + глутаминовая кислота 10 9
Амиды 16 -

Стрептавидин можно использовать вместо авидина или в дополнение к нему в авидин-биотиновых системах. Он коммерчески доступен, и, подобно авидину, его можно очищать с помощью аффинной хроматографии на иминобиотиновой колонке. Поскольку бактериальный белок имеет нейтральную изоэлектрическую точку и не содержит углеводных остатков, то для него нехарактерны неспецифические взаимодействия, свойственные авидину яичного белка. Хотя неспецифическое связывание авидина можно свести к минимуму с помощью химических или каких-либо других методов, стрептавиднн и его конъюгаты являются наилучшим решением этой проблемы.


В лаборатории для разработки различных методов иммуноанализа применяются имеющиеся в продаже конъюгаты авидина с ферментами, а также синтезированные препараты биотинилированных белков и стрептавидина с хемилюминесцентной меткой.

Получение биотинилированных белков

Антитела и ферменты биотинилировали по ранее описанной методике с использованием N-гидроксисукцинимидных эфиров производных биотина с различной длиной алкильной цепи. Структура реагентов и схема реакции представлены на рис. 2. Качество полученных препаратов проверяли с помощью ELISAили двухцентрового иммунометрического анализа.

Получение белков с хемилюминесцентной меткой

Стрептавиднн или очищенные фракции IgG моноклональных антител обрабатывали сукцинимидными производными аминобутилэтилизолюминола. Полученные конъюгаты очищали гельфильтрацией на сефадексе G-25 и хранили при -20°С.


Методы анализа

При разработке методов двухцентрового иммунометрического анализа белков применяли меченые конъюгаты авидина или стрептавидина либо стрептавидин как связующее звено между биотинилированными антителами и биотинилированным ферментом. Величину сигнала в ферментативной реакции как в том, так и в другом случае определяли спектрофотометрически или по интенсивности люминесценции в зависимости от типа используемой метки.

Авидин и стрептавидин в качестве меченых зондов

Принципиальная схема этого метода представлена на рис. 3.Исследуемый образец инкубировали с высокоаффинными моноклональными антителами, ковалентно связанными с полистирольными шариками диаметром 6,5 мм. Затем в систему вводили биотинилированные антитела к другим эпитопам антигена. По завершении иммунологической реакции добавляли авидин, меченный ферментом, или содержащий хемилюминесцентную метку стрептавидин. В зависимости от используемого маркера измерение осуществляли спектрофотометрически или по интенсивности люминесценции.

Определение с помощью спектрофотометрии

Для изучения влияния длины цепи между молекулой биотина и моноклональным антителом на чувствительность анализа применяли систему, в которой избыток моноклональных аити-hGH антител был ковалентно связан с полистирольными гранулами. Гранулы инкубировали со стандартными препаратами или с пробами и с двумя различными препаратами биотинилированных моноклональных hGH-антител, различающимися длиной цепи, соединяющей молекулу биотина и антитела. По завершении реакции антиген – антитело в систему добавляли конъюгатавидин – щелочная фосфатаза и смесь инкубировали в течение 30 мин. Растворы упаривали в токе воздуха, добавляли субстрат м-нитрофенилфосфат и смесь инкубировали 45 мин при 37°С.

Образовавшийся продукт ферментативной реакции определяли по поглощению при 405 нм. Экспериментальные данные представляли в виде графика зависимости логарифма оптической плотности от логарифма концентрации hGH. Полученные данные свидетельствуют, что более крутой наклон наблюдается в случае антител клона №69, биотинилированных с помощью N-гидроксисукцинимидного эфира с длинной цепью CONH3 -). Чувствительность анализа, достигаемая с длинноцепочечными биотинилированными антителами клона №69, сравнима с чувствительностью определения гормона с помощью обычного конкурентного РИА.


Определение путем измерения интенсивности люминесценции

Кроме спектрофотометрии для определения связанных биотинилированных антител мы также использовали измерение интенсивности люминесценции. На этом рисунке символом L обозначен хемилюминесцентный маркер, а моноклональные антитела к hGHбиотинилировали через длинную цепочку CONH3-). В данном методе моноклональные антитела, связанные с полистирольными гранулами, инкубировали со стандартами или пробами и с длинноцепочечными производными биотинилированных антител анти-hGHпри комнатной температуре.

По завершении иммунологической реакции добавляли стрептавидин, несущий хемилюминесцентную метку. Через 30 мин гранулы промывали. Интенсивность свечения связанной метки регистрировали при щелочном рН с использованием системы микропероксидаза – пероксид водорода. Калибровочный график зависимости логарифма интенсивности хемилюминесценции от логарифма концентрации hGH представлен на рис. 5. Предел обнаружения гормона с помощью данного метода составляет 3-10-5 м.ед. hGH/л или 1,5 пг в пробирке, а рабочий диапазон – от 4–10-5 до 10-1 м.ед. hGH/л. Коэффициент вариации анализа внутри серии равен 5,5%.

Нормальный уровень hGH и его динамические изменения при искусственной стимуляции у здоровых пациентов определяли с помощью обычного РИА и двухцентрового иммунометрического анализа. Коэффициент корреляции обоих методов составил 0,96. Кроме того, метод ИХМА позволил определить уровень базальной секреции и слабые изменения концентрации hGH в плазме крови у больных гипопитуитаризмом в течение циркадного цикла, что невозможно сделать с помощью обычного РИА. Полученные данные показывают, что люминесцентный ИХМА в 10 раз более чувствителен, чем существующие радио- и иммуноферментные методы определения hGH.


Стрептавидин и биотинилированные ферменты какзонды

Принципиальная последовательность операций в этом методе представлена на рис 7. Связанные с носителем и биотинилированные моноклональные антитела инкубировали с пробой или стандартами. По завершении иммунологической реакции последовательно добавляли или стрептавидин и биотинилированную щелочную фосфатазу, или ацетилированный авидин и биотинилированную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу. В зависимости от фермента величину сигнала регистрировали спектрофотометрически или по интенсивности люминесценции. Примером такого подхода может служить определение hGHс помощью иммобилизованных на полистирольных гранулах моноклональных антител анти-hGHи модифицированных длинноцепочечным производным биотина антител анти-hGH клона №69. Гранулы отмывали и последовательно инкубировали при комнатной температуре со стрептавидином и длинноцепочечным производным биотинилированной щелочной фосфатазы. После промывки добавляли раствор j-нитрофенилфрсфата. Образование продукта регистрировали по поглощению при 405 нм. Калибровочный график для определения hGH, полученный с помощью биотинилированной щелочной фосфатазы и спектрофотометрического определения продукта ферментативной реакции, представлен на рис. 8.


Чувствительность анализа сравнима с чувствительностью методов типа РИА. Коэффициент вариации внутри серии при анализе смешанной плазмы с концентрацией hGH 7.6–10"3 м.ед./л равен 6,5%, а коэффициент вариации между сериями при анализе того же пула – 7,4%.

На рис. 9 приведены результаты анализа образцов плазмы, взятых у пациентов, подвергнутых тесту «на стимуляцию секреции гормона роста. Полученные данные свидетельствуют, что с помощью этого метода можно регистрировать и количественно определять реакцию в тестах по стимуляции и подавлению синтеза hGH, проводимых для оценки резервов гормона в гипофизе. Все применявшиеся в этом методе реагенты устойчивы в течение по меньшей мере двух лет. Диапазон калибровочной кривой позволяет определять в одном анализе высокие и низкие концентрации hGH.


Заключение

Сравнительные данные для двух методов двухцентрового иммунометрического анализа hGH приведены в табл. 2. Чувствительность использованного для сравнения метода РИА составляла 0,6–10-3 м.ед./л, а рабочий диапазон – 10-3 м.ед./л.

Оценить/Добавить комментарий
Имя
Оценка
Комментарии:
Где скачать еще рефератов? Здесь: letsdoit777.blogspot.com
Евгений06:49:18 19 марта 2016
Где скачать еще рефератов? Здесь: letsdoit777.blogspot.com
Евгений22:36:08 18 марта 2016
Кто еще хочет зарабатывать от 9000 рублей в день "Чистых Денег"? Узнайте как: business1777.blogspot.com ! Cпециально для студентов!
13:17:32 25 ноября 2015

Работы, похожие на Реферат: Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе

Назад
Меню
Главная
Рефераты
Благодарности
Опрос
Станете ли вы заказывать работу за деньги, если не найдете ее в Интернете?

Да, в любом случае.
Да, но только в случае крайней необходимости.
Возможно, в зависимости от цены.
Нет, напишу его сам.
Нет, забью.



Результаты(150053)
Комментарии (1830)
Copyright © 2005-2016 BestReferat.ru bestreferat@mail.ru       реклама на сайте

Рейтинг@Mail.ru